Skip to content

Mutacje somatyczne w mózgowych malformacjach korowych AD 3

1 miesiąc ago

429 words

Aby wykryć mozaikowatość 5% lub wyższą, biblioteki przygotowano i sekwencjonowano w wielu partiach w celu osiągnięcia średniej głębokości co najmniej 200x (Fig. S2 w Dodatku Aneks). Szczegóły dotyczące przygotowania próbek i metod bioinformatycznych znajdują się w Dodatku Uzupełniającym. Sprawdzanie sekwencji Sanger
Sekwencjonowanie Sangera stosowano do walidowania wszystkich wariantów rzadkich i zmieniających białko (niesonimicznych, bezsensownych, splicingowych, przesunięć ramkowych i insercji-delecji [indel]) w docelowych genach. Sprawdzone warianty zostały przetestowane pod kątem segregacji rodzinnej, gdy dostępne były próbki od rodziców lub rodzeństwa. Rodzicielstwo potwierdzono przy użyciu zestawu AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Life Technologies).
Kryteria patogenności
Zdefiniowaliśmy patogenne mutacje jako te, które spełniały następujące kryteria: występowały w genach, które, gdy są zmutowane, powodują zaburzenia; byli nieobecni w kontrolach (tj. próbki w projekcie Exome Sequencing Project, dbSNP i 1000 Genome); przewidywano, że będą zmieniać sekwencję kodowanego białka (mutacje niesynonimowe, nonsensowne, splicingowe, zmiany ramek i indelowe); i zostały przewidywane przy użyciu oprogramowania przewidującego in silico (SIFT16 lub PolyPhen-217), aby niekorzystnie wpływać na funkcję białka. Ponadto, w przypadku wariantów linii płciowej wymagaliśmy, aby odmiana powstała de novo, by segregować z tym zaburzeniem, aby została odziedziczona po rodzicu z mozaikowatością somatyczną lub aby charakteryzować się dominującym lub powiązanym z X sposobem dziedziczenia, gdy odpowiedni. W przypadku sześciu probantów z mutacjami w linii płciowej rodzicielski DNA był niedostępny.
Analiza mutacji somatycznych
Ponieważ częstość odczytu allelu alternatywnego allelu 40% lub niższego znacznie odbiega od stosunku 50:50 oczekiwanego od heterozygotycznych wariantów linii zarodkowej (Fig. S2 w dodatkowym dodatku), warianty, dla których częstotliwość odczytu allelu alternatywnego wynosiła 40% lub oceniane pod kątem potencjalnego mozaikowatości poprzez subklonowanie. Oryginalny DNA ponownie amplifikowano za pomocą testu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), subklonowano do wektora TA (zestaw do klonowania TOPO TA, Invitrogen) i transformowano do komórek TOP10 Escherichia coli. Wiele pojedynczych transformantów ponownie wyizolowano i przeprowadzono sekwencjonowanie Sanger w celu potwierdzenia obecności lub braku przewidywanego wariantu i ilościowego określenia stopnia mozaicyzmu.
Wyniki
Ukierunkowane sekwencjonowanie następnej generacji
Tabela 1. Tabela 1. Szczegóły dotyczące Mutacji Mozaiki. Ryc. 1. Ryc. 1. Analiza swoistości dla techniki Deep Targeted-Sequencing. Panel A pokazuje stopień sprawdzania poprawności w stosunku do głębokości pokrycia sekwencji dla wariantów linii płciowej i mozaiki, które zostały i nie zostały pomyślnie zweryfikowane
[patrz też: leczenie nadpotliwości, dawca szpiku rejestracja, odbudowa zęba na wkładzie z włókna szklanego ]

Powiązane tematy z artykułem: dawca szpiku rejestracja leczenie nadpotliwości odbudowa zęba na wkładzie z włókna szklanego